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Cultivo celular: fundamentos teóricos-prácticos. Aplicaciones

Docente: Dra. Silvina Nadin, Dr. Darío Cuello-Carrión, Dra. Mariel Fanelli, Dr. Juan Pablo Mackern, Dra. Virginia Pistone, Dra. Marcela Pizarro y Dr. Matías Sánchez (IMBECU - CONICET)

Contenidos

Objetivos:

• Introducir a los fundamentos teóricos-prácticos de las técnicas de cultivo celular eucariota y de la biología de la célula en cultivo.

• Entrenar en los procedimientos básicos para la realización de las metodologías y sus aplicaciones.

1. Introducción al cultivo celular.

a) Infraestructura y equipamiento. Áreas estériles. Niveles de seguridad. Tipos de cabinas de flujo laminar, estufas, autoclave, materiales y reactivos generales de uso común en el cultivo celular.

Trabajo en condiciones asépticas. Métodos de esterilización y desinfección. Controles físicos, químicos y biológicos de esterilización. Normas de Bioseguridad. Buenas prácticas de trabajo en sala de cultivo celular. Contaminaciones más frecuentes. Métodos de detección y monitoreo continuo. Conductas y procedimientos de saneamiento, prevención y tratamiento.

b) Biología de la célula en cultivo. Ciclo celular. Morfología y Viabilidad. Fases de crecimiento.

Requerimientos para su crecimiento: superficies aptas para el cultivo, composición de los medios de cultivo, suplementos y aditivos, constitución de la fase gaseosa, temperatura de incubación, etc. Condiciones de cultivo. Observación al microscopio de fase invertida. Métodos y condiciones de criopreservación.

2. Cultivos de líneas celulares y cultivos primarios.

a) Origen de los cultivos celulares. Cultivos primarios de diferentes orígenes (linfocitos, neuronas, esplenocitos, células mesenquimáticas, etc.). Líneas celulares continuas. Cultivo de células adherentes y de células en suspensión. Líneas celulares certificadas, ATCC. Clonado y selección de tipos celulares. Concepto de Diferenciación y Transformación. Manipulación de líneas celulares. Métodos de repiques y amplificación de cultivos celulares.

b) Métodos de purificación y enriquecimiento de subpoblaciones celulares. Métodos físicos de separación celular basados en el tamaño celular y la velocidad de sedimentación. Separación con perlas magnéticas: diferentes estrategias de aislamiento. Separación mediante cell sorting utilizando citometría de flujo. Otras técnicas.

c) Ensayos de viabilidad celular (Azul de Tripán, MTT, etc.). Recuento y siembra. Estudio de la adhesión y migración celular in vitro: métodos.

3. Producción a gran escala, co-cultivo y cultivo en tres dimensiones. Características y aplicaciones. Clasificación de reactores (reactores tipo tanque agitado, reactores en columna, reactores de membrana, otros). Modos de operación (batch, fed-batch, quimiostato, perfusión). Cultivos adherentes y en suspensión en reactores. Dispositivos de perfusión. Matrices tridimensionales.

4. El cultivo celular en la investigación y como herramienta diagnóstica. Estudios funcionales.

a) Ensayo general de proliferación celular. Ensayos de citotoxicidad. Métodos para la determinación de apoptosis y necrosis celular.

b) Ensayos de linfoproliferación frente a estímulos clásicos y alternativos. Mitógenos. Evaluación de la citotoxicidad. Marcadores de activación. Manipulación y conservación de las muestras.

c) Métodos de transfección celular. Diferenciación celular. Generalidades. Condiciones de cultivo y requerimientos. Análisis de la diferenciación. Aplicaciones. Actividades prácticas:

1- El laboratorio de cultivo celular. Buenas prácticas de laboratorio de cultivo y obediencia de las normas de bioseguridad. Esterilización de material. Preparación de medios de cultivo. Trabajo dentro de la cabina de flujo laminar. Identificación de contaminaciones en cultivos: bacterias, hongos y micoplasma.

2- Cultivo de líneas celulares adherentes. Descongelación a partir de nitrógeno líquido. Tripsinización y repique de líneas celulares adherentes. Conteo, determinación de la viabilidad celular (utilizando colorantes supravitales), siembra de las células y monitoreo del cultivo. Plaqueo. Observación y seguimiento en el microscopio de fase invertida. Confluencia de cultivos. Ensayo de viabilidad utilizando bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio (MTT). Ensayo de migración celular. Criopreservación de líneas celulares.

3- Cultivo de células en suspensión (linfocitos humanos). Purificación de células mononucleares de sangre periférica humana mediante gradiente de centrifugación con Ficoll-Hypaque. Ensayo de proliferación linfocitaria inducida por mitógenos determinada por dilución de CFSE y citometría de flujo. Transfección de líneas celulares en cultivo. Metodología. Determinación del grado de transfección y control.

4- Obtención de medios condicionados a partir del cultivo de explantos de tejido adiposo. Cultivo de neuronas de roedores.

Modalidad

Curso teórico con prácticas demostrativas en sala de cultivo celular.

Arancel

Becarios doctorales de CCT CONICET Mendoza y alumnos del posgrado avalante: $ 1300.

Otros alumnos: $ 1600.

Curso teórico solamente: $ 800.

Carga horaria


Los antecedentes presentados una vez cerrada la preinscripción.